優化Nav1.7靶向鎮痛藥助力揭示蜘蛛毒液衍生肽毒素脫靶效應和改進策略
電壓門控鈉（Nav）通道 Nav1.7 在疼痛信號的感知中發揮著重要作用，抑制 Nav1.7 通道是一種有潛力的止痛治療策略。蜘蛛毒液中多種 Nav1.7 抑制肽具有門控修飾毒素（GMTs）的功能，在新型鎮痛藥開發中備受關注，且可被設計為高親和力和亞型選擇性的模板分子。但研究發現肽毒素選擇性不高，會對其他離子通道或未知靶標產生脫靶作用，引發嚴重副作用。所以，對于 Nav1.7 靶向鎮痛藥，選擇性至關重要，它能減輕副作用，減少非 Nav1.7 靶點對 Nav1.7 肽毒素的損失，提高靶向 Nav1.7 的肽毒素有效濃度。
基于此，湖南師范大學劉中華教授、周熙副教授，湖南理工學院張云霄副教授共同通訊在Advanced Science發表：Optimizing Nav1.7-Targeted Analgesics: Revealing Off-Target Effects of Spider Venom-Derived Peptide Toxins and Engineering Strategies for Improvement相關文章。
研究目的：
探索蜘蛛毒液中 hNav1.7 肽抑制劑在離子通道的交叉活性及揭示其潛在機制，從三個不同的蜘蛛毒素 NaSpTx 家族中選了 8 個肽，結果表明這些肽能抑制 rKv4.2 和 rKv4.3 通道，而抑制該通道可能導致嚴重心臟副作用，這給其在鎮痛藥物開發應用帶來挑戰。基于對肽毒素與 hNav1.7 和 rKv4.2/4.3 分子相互作用的了解，設計出 mGpTx1 類似物 mGpTx1-SA，提高對 hNav1.7 的選擇性，降低對 rKv4.2/4.3 的抑制，使心臟毒性最小化，且在慢性炎癥和神經性疼痛模型中有鎮痛作用。隨著 Nav1.7 作為疼痛治療靶點被積極研究，本研究發現可能為未來藥物發現和開發副作用更小的鎮痛藥物提供見解。
研究結果：
1. 蜘蛛毒液衍生的 Nav1.7 抑制劑對 rKv4.2 和rKv4.3 具有高抑制效果
研究分析蜘蛛毒液衍生肽毒素，新的 HNTX-VIIa 對 hNav1.7 抑制活性高。這些毒素有保守半胱氨酸模式和高度同源的 3D 結構，雖體外藥理表現好，但體內有差異且高劑量有毒性。對 Nav 通道亞型有選擇性，也對心臟 Kv 通道有活性。八種毒素對 rKv4.2/4.3 抑制呈電壓依賴性。除 ProTx-II （Nav1.7 鈉通道的選擇性阻滯劑）外，其他毒性不影響 Nav1.7 激活和失活曲線，在亞飽和濃度下可調節 rKv4.2/4.3 電壓傳感器。
圖1. 來自 NaspTx 家族 1-3 的八種蜘蛛毒素的特性
2. rKv4.2 S3-S4 連接子參與蜘蛛毒液衍生的hNav1.7 抑制劑
先前研究表明，特定連接子對毒素與 Nav1.7 的結合具有重要作用。本研究比對人類、小鼠和大鼠的 Nav1.7 DII 和 Kv4.2/4.3 的 S3 - S4 連接子等，發現相似性高且帶負電荷。通過定點誘變分析，構建突變測定毒素抑制效能變化，表明負殘基和側鏈長度重要，研究其他毒素也顯示多個氨基酸殘基參與結合有差異，解釋了對 rKv4.2 和 rKv4.3 的抑制具有相似性，雖連接體參與結合但不排除其他位點。
圖2. rKv4.2 的 S3-S4 連接子參與了八種毒素與 rKv4.2 的結合
3. HNTX-III 具有靶向 hNav1.7 和 rKv4.2 的重疊藥效團
分子表面分析顯示八種毒素有兩親性生物活性表面特征，以 HNTX - III 為例，評估其與 rKv4.2 的構效關系，結果表明特定殘基突變影響對 rKv4.2 和hNav1.7 的抑制作用，強效類似物對 rKv4.2/4.3 親和力增加，表明藥效團幾乎重疊。
圖3. HNTX-III 與 rKv4.2 相互作用涉及的關鍵殘基
4. mGpTx1的類似物（mGpTx1-SA）與rKv4.2/4.3 相比，hNav1.7 選擇性顯著提高
在探索 rKv4.2 脫靶機制時，試圖設計 HNTX - III 類似物以獲得低 rKv4.2/4.3 活性和高 hNav1.7 活性的優化肽。發現某些突變后選擇性變化，引入 K25A 到 HNTX - III 類似物中導致抑制作用和再折疊效率有變化，說明其可能不是合適模板。mGpTx1有兩個多肽 mGpTx1 - R25A 和 mGpTx1 - SA，其中 mGpTx1 - SA 對 hNav1.7 有強效和選擇性活性，對其他通道影響小，提高了對 hNav1.7 的選擇性比，且對其他 Kv 通道亞型及 Cav 通道抑制作用低。
圖4. mGpTx1-SA 的選擇性分析
5. mGpTx1-SA 通過降低對 rKv4.2/4.3 的抑制作用來消除心臟毒性
抑制 rKv4.2/4.3 可能導致心臟毒性。實驗表明，5μM 的 mGpTx1 延長大鼠心肌細胞動作電位時程（APD），改變小鼠心電圖及 RR 間期和心率等；而 mGpTx1-SA 在相同條件下無影響。總體數據顯示，mGpTx1-SA 不具有延長心肌細胞APD的活性，說明其在降低心臟毒性方面有優勢。
圖5. mGpTx1-SA 的心臟毒性分析
6. mGpTx1-SA 降低背根神經節（DRG）神經元的膜興奮性，防止炎癥和神經性疼痛模型中的機械異常性疼痛
通過電壓鉗記錄評估 mGpTx1 - SA 對 DRG 天然 Na + 和 K + 介導電流的影響，結果表明 mGpTx1 - SA 對河豚毒素敏感 Nav 電流有抑制作用，可能降低 DRG 小神經元的膜興奮性。在疼痛小鼠模型中，mGpTx1 - SA 比 mGpTx1 更有效，抗異動作用持續時間長，在慢性炎癥和神經性疼痛模型中表現出良好的鎮痛作用。
圖6. mGpTx1-SA 對小鼠 DRG 神經元興奮性的抑制作用及鎮痛效果
7. mGpTx1-SA 的體內安全性得到改善
考慮到 mGpTx1-SA 對某些特定通道抑制減弱且這些通道有重要生理功能，測試其對小鼠運動能力的影響。結果顯示，高劑量（2mg/kg，為鎮痛有效劑量 60μg/kg 的 30 倍）的 mGpTx1-SA 不影響小鼠轉棒平衡時間、游泳時間和小腸推進，也不影響小鼠在曠場試驗中的探索和運動行為，表明其體內安全性較好。
結果表明，針對 hNav1.7 的特定蜘蛛肽毒素對 rKv4.2/4.3 的脫靶抑制可能源于其高度的序列保守性。這一發現有助于設計 hNav1.7 特異性鎮痛藥物，以減少對 rKv4.2/4.3 的抑制、減輕相關毒性，進而提高其在治療應用中的適用性。
