利用雙因子技術(shù)穩(wěn)定血管再生并改善心梗后心功的研究
心肌梗死（MI）是一種嚴重的疾病，導致心肌細胞永久性損傷和心臟功能受損。盡管藥物治療和介入技術(shù)降低MI后的死亡率，但恢復心臟正常功能仍面臨挑戰(zhàn)。近年來，干細胞療法，尤其是間充質(zhì)干細胞（MSCs），因其旁分泌作用和再生潛力，成為治療MI的新希望。人脂肪來源的干細胞（hADSCs）因其易獲取、低免疫原性和多向分化潛能，成為研究熱點。然而，MI后的惡劣微環(huán)境限制hADSCs的存活和功能。
基于此，上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心付煒教授團隊近期在《Clinical and Translational Medicine》雜志上發(fā)表"Enhanced human adipose-derived stem cells with VEGFA and bFGF mRNA promote stable vascular regeneration and improve cardiac function following myocardial infarction"相關(guān)文章。
文中闡述了采用化學合成的修飾modified message RNA （modRNA）技術(shù)對hADSCs進行基因修飾，促使其高效表達血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），這兩種因子在血管生成和抗凋亡中發(fā)揮重要作用。結(jié)果證實經(jīng)VEGFA和bFGF mRNA增強的hADSCs可促進穩(wěn)定血管的再生以及抑制細胞凋亡，改善心臟傳導紊亂并提高心功能，為心肌梗死的治療提供新的方向。
研究方法：
文中采用電標測系統(tǒng)（Electrical Mapping）檢測MI后15分鐘和4周的左心室電傳導的變化。分析傳導時間（CT）、傳導速度（CV）和非均勻性指數(shù)，評估正常組、心肌梗死手術(shù)組及治療干預組電整合能力及干預效果。
研究結(jié)果：
1. 在hADSCs中高效轉(zhuǎn)染modRNA
研究通過GFP報告基因驗證修飾信使RNA（modRNA）在人脂肪來源干細胞（hADSCs）中的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24小時后效率達82.93%，且GFP表達持續(xù)至少5天，同時未顯著影響細胞活力。進一步實驗表明，轉(zhuǎn)染VEGFA和bFGF modRNAs的hADSCs在前2天快速分泌目標蛋白，并持續(xù)表達超過5天，但第7天時表達顯著減少。ELISA檢測證實，轉(zhuǎn)染組的蛋白分泌水平在所有時間點均顯著高于對照組。結(jié)果表明，modRNA能夠高效轉(zhuǎn)染hADSCs并快速穩(wěn)定表達目標蛋白。
圖1. modRNA在hADSCs中的轉(zhuǎn)染效率
2. modRNA修飾的hADSCs分泌蛋白的體外功能
研究評估VEGFA和bFGF modRNA轉(zhuǎn)染對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）管形成和遷移能力的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染VEGFA或bFGF modRNA的hADSCs顯著促進HUVECs管狀結(jié)構(gòu)形成和遷移，且雙基因轉(zhuǎn)染組（hADSCsdual）效果最佳。此外，在缺氧條件下，轉(zhuǎn)染VEGFA或bFGF modRNA顯著抑制H9C2細胞凋亡，其中bFGF modRNA的抑制作用更強。同時，轉(zhuǎn)染組條件培養(yǎng)基顯著促進平滑肌細胞（SMCs）增殖，hADSCsdual組效果最為顯著。
圖2. modRNA轉(zhuǎn)染的hADSCs的體外生物學功能
3. hADSCsdual在體內(nèi)改善MI后的心臟功能
研究評估m(xù)odRNA轉(zhuǎn)染的hADSCs在MI治療中的潛力。實驗顯示，MI后大鼠心臟功能顯著下降，而hADSCs移植后主要分布于心臟，且未引起明顯病理改變，表明其安全性良好。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，hADSCsdual組在移植后72小時內(nèi)VEGFA和bFGF蛋白表達顯著高于MI組。超聲心動圖結(jié)果顯示，MI后2周和4周，hADSCsVEGFA組和hADSCsdual組的心臟功能顯著改善，其中hADSCsdual組效果最佳，LVEF和LVFS顯著提升。研究表明，modRNA修飾的hADSCs，尤其是hADSCsdual，在改善MI后心臟功能障礙方面具有顯著治療潛力。
圖3. hADSCs移植后心臟功能的恢復
4. hADSCsdual在體內(nèi)促進MI后左心室電傳導
研究評估MI手術(shù)及治療干預后左心室電傳導的變化。結(jié)果顯示，MI后15分鐘和4周時，MI組的電傳導紊亂，電活動離散度顯著增加。到第四周時，接受hADSCsVEGFA、hADSCsbFGF或hADSCsdual治療的大鼠電傳導更有序，電活動離散度降低。定量分析表明，MI后傳導時間（CT）延長，傳導速度（CV）降低，傳導離散度增加；而治療后CT縮短，CV增加，傳導離散度降低。hADSCsdual組的左心室傳導參數(shù)改善最顯著，表明其作為一種新治療方法在改善左心室電傳導方面具有治療潛力。
圖4. hADSCs移植后左心室電傳導功能的恢復
5. hADSCsdual減少心臟纖維化并保留心室壁厚度建模4周后，HE和Masson染色顯示，hADSCsdual組大鼠心臟再生組織比例增加，左心室瘢痕面積顯著減小，心室壁厚度保持良好。Vimentin染色表明，hADSCsdual組梗死區(qū)浸潤性成纖維細胞數(shù)量較少。結(jié)果表明，hADSCsdual減少心臟纖維化，緩解心室重構(gòu)，并抑制MI引起的心肌損傷進展。
圖5. MI及治療后大鼠心室形態(tài)學分析
6. hADSCsdual減少梗死區(qū)細胞凋亡并促進細胞增殖
研究hADSCs 體內(nèi)植入效果，發(fā)現(xiàn)多數(shù)聚集在梗死區(qū)及邊緣區(qū)，預處理VEGFA和/或bFGF modRNA的hADSCs在梗死區(qū)的存活率顯著更高。TUNEL染色顯示，hADSCsdual組凋亡細胞比例顯著低于hADSCsLuc組。Ki-67染色證實，hADSCsdual顯著促進梗死區(qū)細胞增殖。免疫染色發(fā)現(xiàn)，少量細胞共表達cTnT和Ki-67，但具體細胞類型難以確定。
圖6. MI及hADSCs移植后梗死區(qū)的細胞凋亡與增殖
為驗證hADSCsdual促進血管再生的能力，進行CD31和α-SMA免疫熒光雙染色。結(jié)果顯示，hADSCsdual治療后梗死區(qū)血管數(shù)量顯著增加，且hADSCsVEGFA優(yōu)于hADSCsbFGF，表明VEGFA在血管再生中起關(guān)鍵作用。hADSCsdual組MI區(qū)新生血管共表達CD31和α-SMA，表明形成成熟血管，且邊緣帶毛細血管和成熟血管密度顯著增加。
圖7. 移植4周后梗死區(qū)和邊界區(qū)新生血管形成
研究證明過表達VEGFA和bFGF的hADSCs在MI大鼠模型中的治療潛力。具體而言，心內(nèi)注射這些修飾的hADSCs能夠促進穩(wěn)定的血管再生，從而改善心臟功能和電傳導（圖8）。本研究報道一種結(jié)合干細胞療法和mRNA技術(shù)修復受損心肌的方法，提出一種全面治療MI的新策略。
圖8. 細胞工程建模示意圖，以及通過血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)修飾RNA增強的心肌細胞內(nèi)注射遞送hADSCS作為心肌梗死恢復的新型治療方法的示意圖
