結直腸癌（CRC）是成本最高的健康問題之一，在發達國家癌癥相關死亡率中排名第二。轉移性 CRC 的預后較差，5 年生存率低于 15%。因此，發現能夠實現 CRC 早期診斷、準確預后和個性化治療的分子標志物極為重要，這仍是該領域的一項挑戰。許多蛋白質已被確定為具有臨床價值的潛在生物標志物，它們幾乎是所有細胞功能的直接執行者。此外，蛋白質的顯著多樣性因眾多翻譯后修飾（PTM）而增加，這些修飾可以快速、可逆地響應環境或細胞內刺激，最終將成為有價值的生物標志物候選資源。目前，基于質譜的蛋白質組學能夠同時檢測數千種蛋白質及其表達變化，從而在疾病等特定條件下提供蛋白質組多樣性的全局圖景。

結直腸癌發展過程

PTM 是對特定氨基酸的化學修飾，可調節大多數真核蛋白質的構象、活性、相互作用、穩定性和空間分布，從而作為快速且可逆的開關，以一種非常 “經濟高效” 的方式執行調節功能。磷酸化作為細胞周期、生長、凋亡和信號轉導途徑的主要調節因子就是一個例證。越來越多的證據表明，異常的 PTM 事件與多種人類疾病有關。事實上，磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化、甲基化和瓜氨酸化等 PTM 已被證明在 CRC 的發生、發展和轉移中發揮作用，因此強調了對 PTM 進行全局分析以發現具有生物學和治療潛力的靶點的必要性。

Summary of important PTM events and their involved pathways in CRC

由于蛋白質組中的大多數 PTM 豐度較低且亞化學計量，在沒有預先富集的情況下，無法有效檢測或定量測量。一般來說，用于全局 PTM 分析方法的富集技術根據所涉及的化學原理可分為兩類：共價標記以及感興趣的 PTM 與其選擇性探針之間的非共價相互作用。針對每種類型的 PTM，已經開發了基于這兩種化學類型之一的不同富集策略。隨后，對富集的 PTM 進行蛋白質組學分析，可以使用質譜（MS）解析母離子的特定質量位移和子離子的質量特征。

磷酸化

蛋白質磷酸化通常發生在絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上，是最常見的 PTM 之一，通常作為眾多蛋白質功能的分子開關，負責信號通路的許多關鍵功能。在 CRC 中，大量異常磷酸化與細胞周期依賴性激酶家族蛋白、凋亡調節蛋白、生長因子受體及其下游信號分子密切相關。因此，驅動 CRC 腫瘤發生和發展的磷酸化蛋白質是用于早期診斷、化療耐藥和個體化治療的有價值的生物標志物。傳統的基于抗體的方法，如蛋白質免疫印跡（western blotting）、酶聯免疫吸附測定（ELISA）和免疫組織化學，旨在檢測單個磷酸化蛋白質，但無法對蛋白質磷酸化進行全局分析或識別磷酸化位點。在基于 MS 的蛋白質組學時代，磷酸肽富集和數據采集方面的方法學成果不斷取得進展，使得對參與腫瘤發生和 CRC 發展的復雜信號通路進行磷酸化蛋白質組分析成為可能。

由于磷酸化蛋白質的亞化學計量和低豐度，在質譜分析之前，需要對磷酸化肽進行富集和分離。常用的富集方法包括金屬氧化物親和色譜（MOAC）、固定化金屬離子親和色譜（IMAC）、免疫親和富集和基于結構域的富集。MOAC 和 IMAC 常用于絲氨酸 / 蘇氨酸磷酸化的富集。SIMAC（IMAC 和 MAOC 的組合）進一步提高了磷酸肽的富集效率，能夠對微量樣品中的全局磷酸化蛋白質進行深入分析。由于酪氨酸磷酸化肽約占磷酸肽的 1%，IMAC 和 MOAC 等方法對酪氨酸磷酸化肽的富集效果不佳。相反，一種基于抗體免疫親和的策略已經被開發出來，能夠特異性富集酪氨酸磷酸化肽。此外，受體酪氨酸激酶（RTK）的底物，如 SH2 結構域，也可用于富集含有 SH2 相互作用結構域的酪氨酸磷酸肽。除了在富集技術上的努力，許多研究還致力于在質譜分析之前通過進一步分離來降低富集的磷酸肽的復雜性。常見的分離策略包括強陽離子交換色譜（SCX）、強陰離子交換色譜（SAX）、親水相互作用液相色譜（HILIC）和靜電排斥親水相互作用色譜（ERLIC）。SCX 和 SAX 均基于磷酸肽的電荷分離，而 HILIC 根據磷酸肽的親水性進行分離。ERLIC 通過親水相互作用和靜電排斥將磷酸化肽與非磷酸化肽分離。隨后，富集的磷酸肽可以通過質譜結合成熟的同位素標記技術（如 SILAC、iTRAQ 和 TMT）進行鑒定或定量

Schematic process for phosphopeptides enrichment and subsequent fractionation in MS-based phosphoproteomic analysis

特定信號分子的磷酸化網絡是 CRC 復發和轉移的有價值的生物標志物。基于磷酸化蛋白質組生物標志物的復發風險分層有助于在輔助化療中進行減法操作，以減少毒副作用和第二原發性腫瘤的風險。臨床數據證實，低風險的 II 期 CRC 患者無法從輔助化療中獲益，而在低風險的 III 期 CRC 患者中，3 個月的輔助化療并不遜色于 6 個月的輔助化療。比較磷酸化蛋白質組學研究表明，SW480 細胞中細胞周期蛋白依賴性激酶 2（CDK2）在 Tyr15 位點的磷酸化水平比 SW620 細胞高 3.3 倍。因此，臨床患者隊列數據顯示，CDK2 在 Tyr15 位點的磷酸化是低復發風險的生物標志物。在不久的將來，Tyr15 位點磷酸化 CDK2 水平較高的 II 期 CRC 患者可能無需輔助化療即可安全管理。手術切除是治療肝轉移最有效的根治性治療方法，估計 5 年生存率為 50%；然而，只有約 25% 的患者符合手術切除條件。轉移的早期診斷可以提高轉移性 CRC 的根治性（R0）切除率和預后，目前迫切需要經過驗證的生物標志物。一項針對中國 CRC 患者隊列的綜合組學研究表明，基于原發性腫瘤的磷酸化蛋白質組數據可以區分轉移性和非轉移性 CRC。轉移性 CRC 的磷酸化蛋白質組數據的顯著特征是 MHC1 中磷酸化位點的下調以及 mTOR 信號通路和糖酵解途徑中磷酸化位點的上調，這些可能是轉移性 CRC 的潛在診斷生物標志物和潛在治療靶點。參與抗原加工和呈遞途徑的 MHC1 的磷酸化有可能成為抗腫瘤免疫治療的生物標志物和靶點。

KRAS 突變是預后不良和對抗 EGFR 治療耐藥的重要預測生物標志物，常見于 KRAS 基因外顯子 2 的密碼子 12（G12D）和 13（G13D）。然而，不同的 KRAS 突變似乎與不同的臨床病理特征和對抗 EGFR 治療的不同藥物敏感性相關，這表明不同的 KRAS 突變會導致不同信號通路的激活。Raish 等人利用基于免疫親和富集的磷酸化蛋白質組學揭示了 KRAS G12D 和 G13D 等位基因的磷酸酪氨酸特征。結果表明，兩種 KRAS 突變存在不同的信號通路和代謝重編程模式。髓鞘蛋白零樣 1（MPZL1）蛋白在 Tyr263 位點的過度磷酸化是 G12D 突變下游的一個新分子，敲低 MPZL1 與對 EGFR 抑制的敏感性增加有關。因此，MPZL1 可能作為 KRAS G12D 的生物標志物和潛在治療靶點。研究人員越來越多地利用磷酸化蛋白質組學探索新的生物標志物，為攜帶 KRAS 突變的 CRC 提供更個性化的治療選擇。

抗表皮生長因子受體（anti-EGFR）單克隆抗體，如西妥昔單抗和帕尼單抗，是治療 KRAS 野生型轉移性 CRC（mCRC）的基石。然而，50% 的 RAS 野生型 CRC 患者對西妥昔單抗耐藥，且目前仍缺乏經過驗證的西妥昔單抗耐藥生物標志物。西妥昔單抗耐藥細胞的磷酸化蛋白質組數據顯示，SRC-PRKCD 途徑顯著激活，SRC 抑制劑可逆轉西妥昔單抗耐藥。在 SRC 過表達的結直腸癌細胞中，酪氨酸磷酸化網絡顯示 SRC 與其他酪氨酸激酶途徑（如 MET、EphA2 和 SGK223）之間存在廣泛的相互作用。基于 MS 的磷酸化蛋白質組學構建的 HGF-MET 信號網絡表明，MET 和 SRC 信號之間存在許多連接節點。因此，EGFR 下游途徑的激活可能被視為抗 EGFR 單克隆抗體耐藥的關鍵生物標志物，也是逆轉 CRC 中抗 EGFR 治療耐藥的有效治療靶點。

總之，蛋白質磷酸化是 CRC 中用于術后復發風險分層和轉移性 CRC 個體化治療的重要生物標志物。然而，目前大多數關于磷酸化蛋白質組學生物標志物的研究受樣本量小的限制，仍處于臨床前階段。目前基于 MS 的 CRC 磷酸化蛋白質組學研究已整理在表 1 中。顯然，迫切需要對磷酸化蛋白質組學進行更大規模的前瞻性隊列研究，以及方法學優化和成本降低，以促進其在臨床實踐中的應用。

乙酰化

賴氨酸乙酰化和去乙酰化是動態且可逆的 PTM，其中乙酰基轉移到賴氨酸殘基的 ε- 氨基上。乙酰化的動態平衡由賴氨酸乙酰轉移酶（KATs，也稱為組蛋白乙酰轉移酶）和賴氨酸去乙酰化酶（KDACs，也稱為組蛋白去乙酰化酶）調節。50 多年前首次在組蛋白中描述的賴氨酸殘基乙酰化，會導致賴氨酸殘基的正電荷中和，誘導染色質結構松散和轉錄激活。除組蛋白外，乙酰化修飾也存在于非組蛋白蛋白質中，并廣泛參與信號轉導、細胞周期、染色質重塑、DNA 修復和復制、RNA 剪接、蛋白質穩定性和運輸以及轉錄調控。越來越多的數據表明，乙酰化與腫瘤發生和癌癥進展密切相關。組蛋白乙酰化導致癌基因和抑癌基因的轉錄活性異常，而非組蛋白乙酰化導致促癌因子和抑癌因子的穩定性和活性改變。因此，組蛋白和非組蛋白蛋白質的乙酰化是腫瘤發生和進展的關鍵生物標志物，也是治療干預的潛在靶點。高分辨率質譜結合液相色譜以擴大乙酰化的檢測范圍，將加深我們對乙酰化在癌癥中作用的理解，并促進乙酰化新生物標志物的發現。

基于 MS 的自下而上蛋白質組學已成為蛋白質乙酰化和位點鑒定的主要方法。蛋白質乙酰化分析的主要挑戰是乙酰化蛋白質的化學計量比和豐度較低。因此，乙酰化肽的富集和分離是蛋白質乙酰化鑒定和定量的關鍵步驟。使用抗乙酰化賴氨酸抗體進行免疫親和純化富集可提高乙酰化 MS 分析的深度。SCX 是最常用的分離策略，通常與免疫親和純化富集相結合。

越來越多的證據表明，組蛋白乙酰化的失調與結直腸癌的發生和預后密切相關，涉及多種失調的酶，包括 KATs 和 KDACs。對結直腸癌樣本和配對正常黏膜樣本中組蛋白 PTM 的基于 MS 的分析表明，CRC 中組蛋白 H3 賴氨酸 27（H3K27ac）的乙酰化顯著增加。一些報告表明，全局組蛋白乙酰化是結直腸癌晚期、淋巴結轉移、預后不良和高復發風險的生物標志物。原發性結直腸癌組織和肝轉移組織中乙酰化組蛋白的蛋白質組學研究，描述了原發性腫瘤和轉移組織中乙酰化組蛋白的不同表達，結果顯示肝轉移中乙酰化組蛋白 H3/H2 在 Lys 19 和 H2B 在 Lys 121 處的變化最大。然而，一些特定乙酰化組蛋白的表達增加與良好的預后相關，例如，H3K12ac 和 H3K18ac 是組織學亞型分化較好的生物標志物，H3K56ac 和 H4K16ac 是復發風險較低和生存期較長的生物標志物。進一步明確組蛋白乙酰化及其下游靶基因在 CRC 腫瘤發生和轉移中的作用，將有助于深入理解組蛋白乙酰化在癌癥生物學中的意義。

非組蛋白乙酰化在 CRC 中也起著至關重要的作用，例如在 p53 中。基于 MS 的非組蛋白蛋白質乙酰化蛋白質組學表明，IDH1 K224 在轉移部位的乙酰化水平顯著增加，高水平的乙酰化 IDH1 與 CRC 中的晚期腫瘤、肝轉移和生存率降低顯著相關。因此，IDH1 乙酰化是 CRC 有前景的生物標志物和未來的治療靶點。基于 MS 的 EGFR 的 PTM 鑒定出人類 CRC 細胞中 EGFR 的一種新修飾，K1037 乙酰化，由上游抗氧化多功能酶硫氧還蛋白（SRX）調節，它抑制 EGFR 磷酸化和激活。EGFR 的 PTM 與 EGFR 途徑的激活和抗 EGFR 治療的療效密切相關，這是逆轉西妥昔單抗耐藥的一個有前景的方向。

組蛋白和非組蛋白蛋白質的乙酰化是 CRC 的重要生物標志物，靶向乙酰化的療法，如組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACis），在臨床前研究中已顯示出在結直腸癌治療中的良好應用潛力。然而，關于基于 MS 的結直腸癌全局乙酰化分析的文獻仍然稀少，迫切需要在結直腸癌的分子生物學研究中更廣泛地應用最先進的特定蛋白質組學方法來研究乙酰化。

糖基化

糖基化是最常見的翻譯后修飾之一，包括兩種主要類型的糖基化：發生在天冬酰胺殘基上的 N - 糖基化和發生在絲氨酸或蘇氨酸氨基酸殘基上的 O - 糖基化。這是一個在內質網腔和高爾基體中進行的多步酶促過程，參與信號轉導、免疫反應和癌癥相關生物學等多個生物學過程。糖基化事件以及糖基化相關酶系統的失衡與多種病理狀況（如癌癥甚至 COVID-19）相關，在診斷和治療的生物標志物中起著至關重要的作用。在結直腸癌中，生長因子受體（如 EGFR）的糖基化會改變藥物 - 受體相互作用，可能是抗 EGFR 治療耐藥的潛在生物標志物，而參與糖基化的 N - 乙酰葡糖胺轉移酶 V 與腫瘤發生和轉移相關，可能是診斷和預后的潛在生物標志物。基于質譜的糖蛋白質組學系統地表征糖蛋白的糖基化位點和聚糖結構，有助于我們理解糖基化在結直腸癌腫瘤發生和進展中的生物學作用，并發現用于診斷和治療的生物標志物。

糖基化肽的富集是蛋白質糖基化全局分析的關鍵步驟。傳統的富集策略包括凝集素親和色譜和酰化化學富集，這些方法通過去除糖鏈結構進行簡化，也稱為去糖蛋白質組學，但缺乏關于聚糖的重要信息。隨著基于 MS 的糖蛋白質組學富集策略和技術的進步，糖型和糖基化位點正成為糖基化鑒定的主要目標。新的策略包括同位素靶向糖蛋白質組學（IsoTaG）、N - 連接聚糖和含糖基化位點肽的固相萃取（NGAG）以及基于硼酸的化學富集。IsoTaG 能夠在全蛋白質組水平表征完整的、代謝標記的糖肽，但僅限于培養細胞樣本。NGAG 能夠表征單個糖基化位點的聚糖異質性，用于系統地表征 N - 糖蛋白質組。Yang 及其同事開發了一種基于硼酸修飾的介孔磁性顆粒的多模態材料，在富集微量樣本中的糖肽方面非常有效。基于 MS 的蛋白質糖基化測定的另一個技術問題是糖基化后沒有恒定的質量位移。因此，需要建立糖基化的質量標簽，以便使用 MS 識別糖基化位點。N - 糖基化的質量標簽通常由 PNGase F 水解或化學去糖基化產生，而 O - 糖基化的質量標簽由 β-elimination產生。

Enrichment strategies and mass tags for glycoproteomics.

癌細胞分泌的糖蛋白和位于細胞膜表面的糖蛋白是結直腸癌早期診斷的關鍵線索。糖蛋白質組學鑒定了結直腸癌中糖蛋白的差異表達，發現如ICAM1、APMAP、Annexin 4、Annexin 5、Annexin A1和CLCA1等膜結合糖蛋白是結直腸癌診斷的敏感且特異的生物標志物，這些標志物需要在血漿[86–89]中驗證。來自血漿中與癌癥相關的外顯子的FGB）和β2-GP1在結直腸癌的診斷中比CA199具有更高的靈敏度和特異性。結直腸癌細胞的外囊泡糖蛋白質組學顯示，轉移細胞中的O-GlcN 蛋白水平高于非轉移細胞。O-GlcN 的胞外囊泡蛋白可能在腫瘤細胞中傳遞距離信息的功能，并可成為結直腸癌轉移的潛在生物標志物。綜上，糖基化蛋白是結直腸癌的重要生物標志物，而糖基化免疫球蛋白可能是結直腸癌免疫治療的潛在生物標志物和潛在靶點。

總結

基于質譜的蛋白質組學發現大量具有 CRC 診斷或治療潛力的蛋白質靶點，多種蛋白質翻譯后修飾（PTM）及修飾位點被發現與 CRC 發生、發展和干預的分子機制密切相關。

• PTM 研究范圍與方法：目前關于 CRC 中 PTM 的研究多集中在磷酸化、乙酰化和糖基化等少數幾種，而其他 PTM（如甲基化、泛素化、瓜氨酸化）作用漸顯，需系統探索更多 PTM 的功能機制，且當前富集策略和質譜方法有待改進以全面分析每種 PTM。
• PTM 間的相互作用：盡管對多種 PTM 在生物過程中的研究增多，但 PTM 間的串擾（多種 PTM 的協調）未得到充分關注，雖已發現一些 CRC 中 PTM 串擾的證據（如 PRMTs 和 EGFR 相關的 PTM 串擾），但還需進一步功能測定來研究其相互作用。
• 臨床轉化：大量臨床研究已鑒定出數千種與疾病相關的 PTM，但其臨床轉化不成熟，作為生物標志物的重要性缺乏大規模臨床試驗驗證，檢測和富集這些 PTM 的抗體匱乏阻礙了常規臨床技術應用，研究人員嘗試探索質譜（MS）在臨床的應用，雖 MS 尚未成為臨床診斷常規工具，但有望成為測量具有臨床潛力的翻譯后修飾肽和蛋白質的有力手段 。

斯達特提供大量優質泛修飾抗體微球，可用于PTM蛋白富集，下游和直接用于質譜應用，歡迎選購！

貨號	產品名稱	反應種屬	修飾
S0F0006	Anti-2-hydroxyisobutyryllysine agarose Beads	Species Independent	Khib（賴氨酸2羥基異丁酰化）
S0F0005	Anti-K-ε-GG agarose Beads	Species Independent	泛素化
S0F0010	Anti-Succinyllysine agarose Beads	Species Independent	琥珀酰化
S0F0007	Anti-Phosphotyrosine agarose Beads	Species Independent	酪氨酸磷酸化
S0F0003	Anti-L-lactyllysine agarose Beads	Species Independent	乳酸化
S0F0009	Anti-O-GlcNAc agarose Beads	Species Independent	糖基化
S0F0004	Anti-acetyllysine agarose Beads	Species Independent	賴氨酸乙酰化
S0F0013	Anti-K-ε-GV Agarose Beads	Species Independent	猶素化

Reference
https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2022.188735

產品信息


杭州斯達特 (www.starter-bio.com)志在為全球生命科學行業提供優質的抗體、蛋白、試劑盒等產品及研發服務。依托多個開發平臺：重組兔單抗、重組鼠單抗、快速鼠單抗、重組蛋白開發平臺（E.coli,CHO,HEK293,InsectCells）,已正式通過歐盟98/79/EC認證、ISO9001認證、ISO13485。