Elispot（酶聯免疫斑點檢測）樣本制備介紹
Elispot（酶聯免疫斑點檢測）是一種高靈敏度的技術，用以檢測單個細胞分泌的細胞因子或其它生物分子。Elispot技術作為疫苗研究免疫原性驗證的金標準，其中單核免疫細胞的質量對實驗結果起著決定性的作用。因此單核免疫細胞的制備流程中一些可能影響細胞活率和功能的細節需要特別注意。
目前常見的樣本類型包括人的外周血單核細胞（PBMC）、動物脾臟提取單核細胞以及腫瘤浸潤淋巴細胞等。Elispot實驗對于細胞的活率要求較高，通常在90%以上的活率，能保證準確的結果，有些樣本受限不能拿到高活率的，則可將細胞活率降至80%。我司對于人外周血以及小鼠脾臟組織提取單核細胞實測數據如下：
表1:不同樣本類型的細胞活率比較
二、PBMC細胞提取注意事項
1. 人外周血離體后，放入抗凝劑的管子中，推薦使用肝素鈉，不建議使用EDTA，同時放置在室溫中，不要放置在低溫環境中，否則會影響細胞提取的活率，放置時間不要超過8小時。2. 細胞脾臟組織需要新鮮分離的脾臟，禁止凍存，同時將脾臟組織上的脂肪組織去除干凈，研磨制備單細胞懸液的過程要盡量迅速，盡量在5分鐘內完成，離心前的所有操作。3. 所有用以提取分離單核淋巴細胞的試劑均應提前置于室溫平衡。4. 離心機溫度設置為25℃，切勿設置低溫！5. 密度梯度離心的第一步離心，降速和升速制動均設置為2或以下。6. 使用凍存的細胞來進行實驗時，需提前復蘇細胞，然后在細胞培養箱里至少靜置1小時，再用來進行后續實驗。7. 細胞凍存時使用含10%DMSO/90%血清的凍存液，使用程序降溫盒逐步降溫，后置于液氮罐中保存。短期如3天內可放置于-80℃冰箱保存。長期保存則放置于液氮罐中。8. PBMC細胞制備過程中，需要將紅細胞去除干凈，若分離過程中仍有紅細胞存在可考慮使用裂紅的方法去除。
表2. 不同凍存溫度下pbmc細胞活率
1.細胞活率方面超低溫運輸（-196℃）結果明顯優于低溫運輸（-80℃），但在T細胞活率方面兩者無明顯差別。
2.將不同溫度條件下寄送的PBMC樣本復蘇后，進行Elispot實驗，都分別使用兩種不同的抗原進行免疫刺激，然后比較不同運輸條件下對抗原的相應差異，結果表明超低溫運輸條件下有更好的抗原免疫反應。
1. 背景信號升高死細胞會釋放蛋白酶，核酸酶等物質，可能降解包被抗體或捕獲的細胞因子，導致非特異性結合或者背景斑點增加。
2. 有效細胞數量減少細胞活率低，功能性細胞數目不足，可能導致斑點數量減少，甚至出現假陰性結果。
3. 細胞功能受損CD4+T細胞尤其是DC細胞功能受限，導致分泌細胞因子的功能受損。
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