Author：Katharina Meditz and Beate Rinner

1 原代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的重要性：盡可能接近體內(nèi)
喬治和瑪格麗特·蓋花了近30年的時(shí)間試圖建立一個(gè)不朽的人類細(xì)胞系，以了解腫瘤的生物學(xué)和機(jī)理。在建立了組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室后，喬治·蓋伊取得了巨大的突破——他從宮頸癌中分離出了第一個(gè)腫瘤細(xì)胞系，他將其命名為HeLa。喬治·蓋伊（GeorgeGey）總是說：“癌癥的關(guān)鍵就在我們的指尖上——只要我們能伸手抓住它”。不幸的是，他死于胰腺腫瘤。

自從發(fā)現(xiàn)細(xì)胞系以來，它們的重要性一直在持續(xù)，甚至在增加。原因如下：（i）它們易于處理，（ii）它們提供無限的自我復(fù)制，（iii）它們具有相對(duì)較高的同質(zhì)性，（iv）它們很容易從冷凍庫存中替換。因?yàn)椋╥）細(xì)胞系在傳代過程中容易發(fā)生基因型和表型漂移，（ii）細(xì)胞系在多年內(nèi)儲(chǔ)存不好，（iii）細(xì)胞系亞群引起表型變化，以及（iv），所以沒有陽性而沒有陰性來自不同實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞系顯示不同的核型，因此可能缺乏重復(fù)性。

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)定義
原代培養(yǎng)是直接取自組織的初始培養(yǎng)；它最接近原始組織，是研究的基礎(chǔ)。細(xì)胞可以直接從組織中遷移和生長(zhǎng)（外植體技術(shù)），或者細(xì)胞可以通過酶或機(jī)械方法從腫瘤組織中分離出來。就其生長(zhǎng)行為而言，細(xì)胞可以作為貼壁培養(yǎng)物在體外生長(zhǎng)，也可以懸浮生長(zhǎng)。

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并覆蓋整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶后，必須將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，原代腫瘤細(xì)胞的命名發(fā)生變化，成為細(xì)胞系。有兩類細(xì)胞系，一類是種群無限膨脹的連續(xù)細(xì)胞系，另一類是具有一定壽命的有限細(xì)胞系。目前，在細(xì)胞庫中有大量不同的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系具有很好的特征。然而，建立新的細(xì)胞系仍然是有用的，因?yàn)楫愘|(zhì)性腫瘤需要不同的細(xì)胞系系統(tǒng)來研究腫瘤的生物學(xué)特性。培養(yǎng)時(shí)間很長(zhǎng)的細(xì)胞系可以改變其遺傳和表型特征。

2 從組織到所需細(xì)胞的長(zhǎng)距離
從組織到所需的細(xì)胞可能需要很多時(shí)間，也可能非常棘手；取決于細(xì)胞的生長(zhǎng)行為和現(xiàn)有組織中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。本章概述了腫瘤組織、培養(yǎng)基和細(xì)胞分離。通過使用腫瘤生長(zhǎng)方面的對(duì)比實(shí)例，將解釋從非常侵襲性的NRAS黑色素瘤腫瘤中建立名為MUG-Mel2的細(xì)胞系以及建立非常緩慢生長(zhǎng)的脊索瘤腫瘤，名為MUG-Chor1和MUG-CC1。

2.1 腫瘤組織
拉丁語單詞tumor的翻譯是“腫脹”。著名病理學(xué)家Wallace H.Clark對(duì)單詞tumor給出了極好的定義：“腫瘤是一組異常細(xì)胞，其特征是在時(shí)間上不受限制地生長(zhǎng)，并且能夠在至少三個(gè)不同的組織隔室中生長(zhǎng)——原始隔室、原發(fā)部位的間質(zhì)（腫瘤侵襲）和遠(yuǎn)處的間質(zhì)（腫瘤轉(zhuǎn)移）”。實(shí)體瘤的結(jié)構(gòu)為實(shí)質(zhì)（腫瘤細(xì)胞）和間質(zhì)細(xì)胞（周圍的腫瘤細(xì)胞）。來源于上皮的腫瘤可以顯示出這些間隔與基底層的分離。這意味著腫瘤不僅存在于惡性細(xì)胞，還存在許多其他細(xì)胞。腫瘤微環(huán)境（TME）也是必不可少的.根據(jù)腫瘤實(shí)體的不同，TME可能由免疫系統(tǒng)細(xì)胞、血管和淋巴管細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞和脂肪細(xì)胞組成，數(shù)量差異很大[2].一些細(xì)胞很容易通過典型的形態(tài)進(jìn)行區(qū)分，如上皮部分，主要是具有典型鵝卵石形態(tài)的單個(gè)細(xì)胞，基質(zhì)部分由成纖維細(xì)胞組成，細(xì)胞具有典型的成纖維細(xì)胞雙極紡錘形；免疫細(xì)胞在粘附細(xì)胞或肥大細(xì)胞/macr上方呈現(xiàn)球狀細(xì)胞棺材。

手術(shù)后應(yīng)立即獲取腫瘤組織，移除周圍的腫瘤組織，為避免污染，應(yīng)在PBS+10%PS中進(jìn)行10分鐘的抗生素浴。抗生素浴后，將腫瘤組織轉(zhuǎn)移到PBS或培養(yǎng)基中，然后用剪刀或手術(shù)刀b將組織切成非常小的碎片（1–2 mm³）。將腫瘤組織分解成小塊c后，收集懸浮液，并將PBS或培養(yǎng)基中的腫瘤塊離心。如果方案中有規(guī)定，則將切碎的腫瘤組織d旋轉(zhuǎn)，并在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中設(shè)置不同的部分。

2.2 成功的四個(gè)步驟
在第一步中，腫瘤組織的狀況非常重要。缺血時(shí)間短是一個(gè)優(yōu)勢(shì)，但只要組織在培養(yǎng)基中保持低溫（4°C），你可以在手術(shù)后24小時(shí)從組織中分離細(xì)胞。從手術(shù)到實(shí)驗(yàn)室的組織運(yùn)輸應(yīng)在不含任何添加劑的介質(zhì)中進(jìn)行，如血清（FBS）或抗生素，以防止其干燥。無FBS對(duì)于在運(yùn)輸過程中抑制細(xì)胞生長(zhǎng)很重要。無抗生素，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)室中，每個(gè)組織將在10次抗生素浴中培養(yǎng)10分鐘，以避免污染，如果運(yùn)輸介質(zhì)中含有抗生素，則無法確定抗生素濃度和培養(yǎng)時(shí)間。活細(xì)胞只能從新鮮的活腫瘤組織中分離出來。

創(chuàng)建細(xì)胞系的第二步是知道要分離哪種細(xì)胞，然后跟蹤它們！良好的本能是成功建立細(xì)胞系的必要條件。

在第三步中，每個(gè)腫瘤都需要自己的分離方法，而這種方法和培養(yǎng)基在大多數(shù)文獻(xiàn)中都可以找到。一種非常普遍的方法是機(jī)械分離或用剪刀或鋒利的刀片將組織切割成非常小的碎片——通常為1-2 mm³，可以選擇通過尼龍過濾器（50-100 μm開口）過濾均質(zhì)，旋轉(zhuǎn)并重復(fù)這些步驟以去除死細(xì)胞、碎片，以及各種不同的細(xì)胞類型。

我們必須意識(shí)到，在分離腫瘤細(xì)胞的過程中，可能會(huì)有不同數(shù)量的非腫瘤細(xì)胞，這將使腫瘤細(xì)胞系的建立復(fù)雜化。因此，由病理學(xué)家檢查腫瘤的組織切片以確定存在的腫瘤細(xì)胞的比例非常重要，因?yàn)檫@將影響細(xì)胞系生長(zhǎng)的成功。酶解也是分離單個(gè)細(xì)胞的一種方法：有不同的酶適合將細(xì)胞從實(shí)體瘤中分離出來，并將切碎的組織消化成單個(gè)細(xì)胞。酶的濃度、溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)保持細(xì)胞活力和完整性非常重要。有多種酶可用，包括膠原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和彈性蛋白酶。每種具有不同靶點(diǎn)的酶對(duì)不同的腫瘤具有親和力。

第四步，每個(gè)細(xì)胞需要自己的培養(yǎng)基；因此，在建立任何細(xì)胞系之前，對(duì)所有文獻(xiàn)進(jìn)行徹底研究是一個(gè)先決條件。有多種可用的基本培養(yǎng)基，可以通過不同的添加劑來適應(yīng)細(xì)胞的需要。然而，在生產(chǎn)特定介質(zhì)時(shí)，必須注意保持滲透壓。例如，F(xiàn)BS的增加（從10%增加到30%）會(huì)強(qiáng)烈影響介質(zhì)的滲透壓。相比之下，人體血液的滲透值為300 mOsmolkg^-1，大多數(shù)基本培養(yǎng)基的滲透值為280–340 mOsmolkg^−1。 通過培養(yǎng)基中的添加劑，例如ITS，重組人胰島素、人轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉的混合物，有不同的方法促進(jìn)細(xì)胞的粘附或生長(zhǎng)。細(xì)胞的粘附也可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中涂上各種酶（如纖維連接蛋白或基質(zhì)凝膠）來加強(qiáng)。

2.3 方案：建立貼壁生長(zhǎng)腫瘤的腫瘤細(xì)胞系

• 腫瘤組織的制備：用無菌剪刀或手術(shù)刀去除非腫瘤組織（脂肪組織、血凝塊和結(jié)締組織）。
• 為降低污染風(fēng)險(xiǎn)，建議使用10×PS溶液的抗生素浴，培養(yǎng)約10分鐘。
• 將腫瘤組織從抗生素浴轉(zhuǎn)移到PBS或培養(yǎng)基中。
• 用無菌鑷子、剪刀或手術(shù)刀將腫瘤機(jī)械和/或酶分解成非常小的碎片，以獲得更多的表面以供腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
• 可選：腫瘤塊的渦流。
• 離心并除去上清液。
• 用合適的培養(yǎng)基在不同的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中重新培養(yǎng)（由于培養(yǎng)瓶的過濾作用，細(xì)胞可能比在6孔培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)得更好）
• 在37°C的加濕培養(yǎng)箱中，在CO₂氣氛中培養(yǎng)細(xì)胞（CO₂量取決于所用培養(yǎng)基）。
• 定期對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。
• 當(dāng)整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶過度生長(zhǎng)并消耗培養(yǎng)基時(shí)，需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)（分裂）。
• 亞培養(yǎng)：使用蛋白水解酶（如胰蛋白酶）或更溫和的Accutase使粘附單層脫離。電池接觸中斷，電池處于懸浮狀態(tài)；離心后，可將細(xì)胞接種到具有適當(dāng)細(xì)胞量的新燒瓶和新的新鮮培養(yǎng)基中，以繼續(xù)細(xì)胞生長(zhǎng)。

2.4 特性描述
腫瘤組織中存在大量不同的細(xì)胞，因此盡快對(duì)生長(zhǎng)出的細(xì)胞進(jìn)行定性是非常重要的。癌細(xì)胞的一個(gè)特征是復(fù)制不朽，這意味著癌細(xì)胞的分裂能力是正常細(xì)胞的數(shù)倍。通常只有成纖維細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞上發(fā)育和生長(zhǎng)。成纖維細(xì)胞也有能力在培養(yǎng)物中保持很長(zhǎng)時(shí)間，在培養(yǎng)物中最多可傳代50代。成纖維細(xì)胞的問題在于，它們的形態(tài)并不總是可識(shí)別的，而且成纖維細(xì)胞常常被錯(cuò)誤地與腫瘤細(xì)胞混淆。由于這些原因，必須盡快檢測(cè)腫瘤潛能。在大多數(shù)情況下，一開始只有很少的腫瘤細(xì)胞可用，并且表征方法必須與細(xì)胞數(shù)量相適應(yīng)。在第一個(gè)生長(zhǎng)階段，只能進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。所建立的細(xì)胞系應(yīng)具有與起源組織相同的特征，然而，例如，可以用波形蛋白檢測(cè)間充質(zhì)起源，用細(xì)胞角蛋白檢測(cè)上皮特征。為了檢測(cè)細(xì)胞的腫瘤潛能，可以進(jìn)行集落形成單位分析；該分析只需要少量細(xì)胞，并通過克隆生長(zhǎng)顯示細(xì)胞的腫瘤潛能。腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為非整倍體和染色體不穩(wěn)定性，流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞周期分析可以揭示細(xì)胞的倍體狀態(tài)，而核型分析則揭示腫瘤細(xì)胞的染色體不穩(wěn)定性。腫瘤標(biāo)志物和遺傳圖譜在培養(yǎng)過程中應(yīng)保持恒定表達(dá)；然而，一些標(biāo)記可能在栽培過程中丟失。為了確認(rèn)已建立的細(xì)胞系是從起源組織中發(fā)展而來，強(qiáng)烈建議通過STR分析進(jìn)行DNA分析，以證明腫瘤的身份。

3 關(guān)于建立腫瘤細(xì)胞系的一般提示
一般來說，為了產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞系，細(xì)胞應(yīng)該（i）定期冷凍保存，（ii）傳代100次以上并在培養(yǎng)物中保留12個(gè)月以上，（iii）在培養(yǎng)過程中主要保持其遺傳表型和形態(tài)。

3.1 Hayflick問題
種植過程中的一個(gè)問題是所謂的Hayflick限制。倫納德·海弗利克（Leonard Hayflick）和保羅·穆爾海德（Paul Moorhead）發(fā)現(xiàn)，來自胚胎組織的人類細(xì)胞在培養(yǎng)基中只能分裂有限次。細(xì)胞培養(yǎng)分為三個(gè)階段。來自外植體或組織的細(xì)胞生長(zhǎng)被稱為第一階段。細(xì)胞分裂代表第二階段。然后細(xì)胞在培養(yǎng)基中增殖，這取決于細(xì)胞類型，在一段時(shí)間后，細(xì)胞開始分裂更慢，也可以停止分裂，這被定義為第三階段。Hayflick和Moorhead將生長(zhǎng)停滯現(xiàn)象描述為Hayflick極限或復(fù)制性衰老。如果細(xì)胞減少或停止分裂，應(yīng)將其轉(zhuǎn)移到具有更高細(xì)胞密度的新燒瓶中，F(xiàn)BS濃度可短時(shí)間增加，強(qiáng)烈建議僅改變50%的培養(yǎng)基，以保持自體生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)。培養(yǎng)快速生長(zhǎng)的細(xì)胞比培養(yǎng)緩慢生長(zhǎng)的細(xì)胞容易得多；然而，細(xì)胞可以毫無理由地停止分裂。

3.2 去除其他細(xì)胞

腫瘤組織中存在許多不同的細(xì)胞。為了去除非致瘤細(xì)胞，可以使用選擇性粘附和分離技術(shù)。成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)不同的密度和大小；胰蛋白酶化后，細(xì)胞可以轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。經(jīng)過一段時(shí)間（例如，10分鐘–2小時(shí)），某些細(xì)胞將沉降到底部，剩余的培養(yǎng)基應(yīng)移到新的燒瓶中，并可重復(fù)上述過程。從腫瘤中分離出的細(xì)胞的不同部分也非常有用，如本例中所示，用于建立MUG-Chor1。保持所有的部分都在培養(yǎng)中，希望其中一部分腫瘤細(xì)胞開始生長(zhǎng)！上述成纖維細(xì)胞分離以及提取的部分意味著在細(xì)胞系建立期間培養(yǎng)箱中一次可容納30多個(gè)燒瓶。因此，需要記錄每個(gè)燒瓶的完整描述。原始文化最重要的一點(diǎn)是，在修煉過程中不要丟棄任何東西，要有耐心！在下一篇文章中，將討論三種腫瘤細(xì)胞系的建立。

4 腫瘤細(xì)胞系的建立：三例
4.1 脊索瘤細(xì)胞系的建立
脊索瘤是一種罕見的惡性腫瘤，起源于脊索的胚胎殘余，僅發(fā)生于斜坡至骶骨的中線。手術(shù)加放療是標(biāo)準(zhǔn)治療方法。由于脊索瘤對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化療具有耐藥性，因此迫切需要建立更多的脊索瘤細(xì)胞系來尋找替代治療方案。脊索瘤和由此產(chǎn)生的細(xì)胞系的特征是根據(jù)其形態(tài)，由各種溶酶體、液泡和典型的含藻體表達(dá)。免疫組化顯示brachyury和細(xì)胞角蛋白8陽性，并顯示緩慢的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。建立脊索瘤細(xì)胞系非常困難，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞生長(zhǎng)非常緩慢，并且被其他快速生長(zhǎng)的細(xì)胞包圍，例如基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞。為了去除成纖維細(xì)胞，可以使用選擇性粘附和分離技術(shù)。

4.1.1 骶骨脊索瘤細(xì)胞系MUG-Chor1的建立
為了建立脊索瘤細(xì)胞系，手術(shù)后立即獲取腫瘤組織。在將腫瘤組織機(jī)械分解成約1–2 mm³塊后，將培養(yǎng)物的混合物分為幾部分進(jìn)行。組分I含有機(jī)械分離的腫瘤細(xì)胞。在37℃下用200 μL膠原酶對(duì)腫瘤片進(jìn)行酶處理30分鐘后，組分II包含一個(gè)細(xì)胞組分，組分III僅包含腫瘤片，用蓋玻片壓下，以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。所有組分均在含有10%胎牛血清、1%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鈉（ITS）、2 mM谷氨酰胺和1%青霉素/鏈霉素的Iscove/RPMI 4:1中培養(yǎng)。在37℃下，在5% CO₂的增濕大氣中進(jìn)行培養(yǎng)。脊索瘤細(xì)胞在pH值為7.4時(shí)生長(zhǎng)。經(jīng)過4個(gè)月的培養(yǎng)期和5次傳代后，細(xì)胞出現(xiàn)危機(jī)。FBS濃度從10%增加到20%，ITS濃度從1%增加到5%。在應(yīng)用這些條件1周后，再次使用初始培養(yǎng)基。危機(jī)過后，細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)，并顯示出大約7-10天的倍增時(shí)間。每周更換兩次培養(yǎng)基，每10天在70–80%的匯合點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的分裂。通過PCR定期檢查所有細(xì)胞培養(yǎng)物中的支原體。

4.1.2 斜坡脊索瘤細(xì)胞系MUG-CC1的建立
建立腫瘤細(xì)胞系的另一個(gè)問題是在腫瘤手術(shù)期間維持細(xì)胞的活力。各種手術(shù)技術(shù)，例如，電切鏡，可以對(duì)細(xì)胞的活力產(chǎn)生影響；此外，斜坡脊索瘤細(xì)胞由于生長(zhǎng)緩慢和腫瘤的位置，很難建立。因此，選擇了一種特別小心的手術(shù)方法。格拉茨醫(yī)科大學(xué)的跨學(xué)科顱底單元為四手經(jīng)鼻蝶竇內(nèi)窺鏡手術(shù)的發(fā)展做出了重大貢獻(xiàn)。重點(diǎn)在于仔細(xì)的組織保存和獲取足夠的細(xì)胞材料，作為最佳細(xì)胞培養(yǎng)的先決條件。在適當(dāng)進(jìn)入斜坡區(qū)并暴露腫瘤后，進(jìn)行初步腫瘤去瘤。這種手術(shù)方法的特殊優(yōu)勢(shì)在于直接顯示病變，并有機(jī)會(huì)從活體腫瘤塊中獲得無污染（血液、粘液、粘膜等）和結(jié)構(gòu)完整的腫瘤組織。用于建立細(xì)胞系的原代細(xì)胞取自一名72歲男性患者，該患者因右側(cè)外展神經(jīng)麻痹而被轉(zhuǎn)診到神經(jīng)外科，導(dǎo)致雙眼失明、眩暈和頭暈。機(jī)械分離后，細(xì)胞處于生命狀態(tài)，但生長(zhǎng)緩慢。

如果感興趣的細(xì)胞表現(xiàn)出非常緩慢的生長(zhǎng)行為，則存在其他細(xì)胞消耗培養(yǎng)基并取代腫瘤細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。從培養(yǎng)開始就立即分離細(xì)胞也很棘手，因?yàn)樗鼈冃枰�周圍�?xì)胞中的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。在建立細(xì)胞系MUG-CC1的過程中，B細(xì)胞過度生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞開始死亡，原因可能是快速生長(zhǎng)的B細(xì)胞的培養(yǎng)基消耗或兩種細(xì)胞系的不協(xié)調(diào)。

懸浮細(xì)胞容易與貼壁細(xì)胞分離。然而，正確的分離時(shí)間點(diǎn)很重要；否則，腫瘤培養(yǎng)就會(huì)丟失。在那個(gè)時(shí)間點(diǎn)，當(dāng)懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)，可能會(huì)發(fā)生致命的錯(cuò)誤；在某些情況下，人們錯(cuò)誤地認(rèn)為自發(fā)永生的懸浮細(xì)胞可能是腫瘤細(xì)胞。因此，懸浮細(xì)胞的表征非常重要。

在通過形態(tài)學(xué)建立MUG-CC1的過程中，淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系（LCL）的特征是，淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞與單個(gè)細(xì)胞一起以典型的花環(huán)形態(tài)在懸浮群中生長(zhǎng)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示B細(xì)胞標(biāo)記物（CD19）呈陽性，而T細(xì)胞（CD3）和自然殺傷細(xì)胞（CD56）的標(biāo)記物缺失。細(xì)胞的DNA含量也可用于表征，而腫瘤細(xì)胞主要表現(xiàn)為非整倍體DNA含量，淋巴母細(xì)胞表現(xiàn)為二倍體DNA圖譜。拷貝數(shù)譜顯示了一個(gè)平衡的譜，表明是一個(gè)非致瘤細(xì)胞系。在MUG-CC1-LCL中檢測(cè)到EBV（TC 70和TC 72）的EB2（BMLf1）基因強(qiáng)陽性，表明EBV轉(zhuǎn)染，并解釋了永生狀態(tài)。

4.2 侵襲性生長(zhǎng)黑色素瘤細(xì)胞系MUG-Mel2的建立
細(xì)胞系MUG-Mel2是從一名48歲男性皮膚原發(fā)性潰瘍性黑色素瘤（8.5 mm厚）患者的皮膚轉(zhuǎn)移的新鮮標(biāo)本中獲得的。原發(fā)腫瘤和皮膚轉(zhuǎn)移的遺傳分析顯示NRASQ61R基因突變；未檢測(cè)到BRAF或c-kit突變。腫瘤和已建立的細(xì)胞系表達(dá)黑色素瘤標(biāo)記物，如Melan-A、HMB-45、S100和酪氨酸酶。手術(shù)后立即獲得腫瘤組織（皮膚轉(zhuǎn)移）；在將腫瘤組織機(jī)械分解成約1–2 mm³塊后，將細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% FBS、2 mmL-谷氨酰胺和1%青霉素/鏈霉素的RPMI（加州卡爾斯巴德生命技術(shù)公司）中。黑色素瘤細(xì)胞在pH值為7.4時(shí)生長(zhǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合，并用Accutase從燒瓶中分離。特別是在培養(yǎng)開始期間，細(xì)胞應(yīng)保持在非常高的密度，以促進(jìn)細(xì)胞間的接觸和細(xì)胞生長(zhǎng)。所有細(xì)胞的培養(yǎng)均在37°C、5% CO₂的增濕空氣中進(jìn)行。定期檢查所有細(xì)胞

通過PCR檢測(cè)支原體。圖4.6顯示了從培養(yǎng)開始，在黑色素瘤和周圍成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞中常見的具有三角形樹突形態(tài)的突出細(xì)胞。由于黑色素瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)，其他細(xì)胞如成纖維細(xì)胞被取代。10天后，進(jìn)一步培養(yǎng)純黑色素瘤細(xì)胞，并且上述所有黑色素瘤標(biāo)記物能夠保持在培養(yǎng)基中。

5 質(zhì)量檢查

5.1 記錄和凍結(jié)
細(xì)胞系建立過程中最重要的任務(wù)是保存細(xì)胞培養(yǎng)工作的完整文檔。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)創(chuàng)建合適的標(biāo)簽?zāi)Ｊ健��?duì)于每個(gè)細(xì)胞系，應(yīng)使用單獨(dú)的等分培養(yǎng)基燒瓶。此外，還必須遵守有效期。必須在培養(yǎng)開始期間進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和拍照，并定期進(jìn)行冷凍保存，以獲得不同傳代的冷凍材料。對(duì)于低溫保存，建議使用90% FBS和10% DMSO的混合物。不要冷凍到更少的細(xì)胞；如果你有少量的細(xì)胞，使用體積較小的冷凍瓶。

5.2 污染
細(xì)胞培養(yǎng)中存在多種污染，分為兩個(gè)主要領(lǐng)域：微生物和細(xì)胞間污染。你在一種文化中工作的越多，污染的風(fēng)險(xiǎn)就越大。一次只能處理一個(gè)細(xì)胞系，尤其是處理原代細(xì)胞時(shí)。需要無菌技術(shù)來防止微生物污染。

5.2.1 微生物污染
細(xì)胞培養(yǎng)中的主要污染物是細(xì)菌、支原體、真菌、酵母和病毒。污染源可能是不良的無菌技術(shù)、介質(zhì)添加劑或腫瘤組織（例如支原體）。必須對(duì)污染進(jìn)行監(jiān)測(cè)和測(cè)試。易于檢測(cè)的有細(xì)菌（濁度增加或混濁、細(xì)顆粒、移動(dòng)）、酵母（短鏈的小橢圓形生物體）和真菌（細(xì)絲狀菌絲體），而支原體和病毒更難檢測(cè)。支原體是小型原核生物，顯微鏡下無法觀察到它們的存在。支原體污染的后果可能包括生長(zhǎng)速率效應(yīng)，染色體改變核酸和氨基酸合成，以及膜改變。許多不同的支原體檢測(cè)方法在成本、時(shí)間、可靠性、特異性和敏感性方面都有優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)。PCR和ELISA技術(shù)為檢測(cè)支原體提供了一種非常敏感、特異和快速的選擇，同時(shí)覆蓋了廣泛的支原體檢測(cè)范圍。最難檢測(cè)的污染是病毒污染，但除非是細(xì)胞病變，否則它們可能對(duì)宿主細(xì)胞幾乎沒有影響。

5.2.2 細(xì)胞污染
“假”細(xì)胞系——30多年前，通過證明細(xì)胞系被HeLa細(xì)胞污染，強(qiáng)調(diào)了培養(yǎng)中細(xì)胞的交叉污染。特別是在使用原電池時(shí)，很容易發(fā)生電池間污染。細(xì)胞錯(cuò)誤識(shí)別的原因可能是人為錯(cuò)誤（錯(cuò)誤標(biāo)記、未消毒的工作條件、交叉污染）或所用技術(shù)的不良結(jié)果（使用飼養(yǎng)層或異種移植）。你在一種文化中工作的越多，污染的風(fēng)險(xiǎn)就越大。一次只能處理一個(gè)細(xì)胞系，并確保每個(gè)細(xì)胞系都有自己的培養(yǎng)基、胰蛋白酶和PBS。特別是貼壁細(xì)胞由于其形態(tài)可以保持分離，但原代細(xì)胞的形態(tài)尚不清楚。為了確保使用正確的細(xì)胞，應(yīng)該進(jìn)行DNA分析。STR DNA分析技術(shù)用于人類細(xì)胞系、干細(xì)胞和組織的常規(guī)鑒定（鑒定）。STR分析是指短串聯(lián)重復(fù)序列DNA，用于檢測(cè)DNA中的各個(gè)區(qū)域。某些DNA區(qū)域的差異可以用來區(qū)分個(gè)體。然而，人類STR分析僅限于物種鑒定。這意味著無法識(shí)別來自其他物種（如小鼠或大鼠）的細(xì)胞系的污染。在基于人類的STR分析中，未檢測(cè)到非人類DNA的存在。動(dòng)物物種可以通過同工酶分析來檢測(cè)。即使在建立細(xì)胞系的過程中，交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)也非常高！因此，切勿同時(shí)處理原代細(xì)胞培養(yǎng)和連續(xù)細(xì)胞系。