陽離子交換層析在ADC純化中的應用
抗體偶聯藥物（Antibody–drug conjugates，ADCs）被譽為腫瘤治療的“生物導彈”，通過抗體靶向腫瘤細胞，精準釋放細胞毒性載荷，極大提升了療效并降低系統毒性。
自2000年首款ADC藥物Mylotarg上市以來，全球已有超17款ADC獲批（截止到2024年），覆蓋血液瘤和實體瘤，市場估值超百億美元。而ADC的復雜結構（由抗體、連接子及有效載荷組成，如Fig.1所示）對生產工藝提出了極高要求。本文將聚焦陽離子交換層析在ADC高效純化中應用。
Fig.1 Anti-CD30 MMAE conjugate (brentuximab vedotin; Adcetris®)結構
生物制品工藝開發的核心目標在于構建穩健可控的生產工藝體系，確�？芍貜椭苽涑龇项A設質量屬性的優質產品。對于傳統非抗體偶聯藥物（Non-ADC biologics），其關鍵質量屬性（Critical Quality Attribute, CQA）包括可能影響臨床安全性與有效性的關鍵指標，如產品大小相關變異體（如聚集體、片段）、電荷異質性、氧化變體等，工藝相關雜質（宿主細胞蛋白、DNA殘留）、濃度、活性等。而抗體藥物偶聯物由于兼具生物大分子與化學小分子的雙重特性，還需額外關注其他質量屬性，包括藥物抗體比率（Drug-to-Antibody Ratio, DAR）、DAR值的組成、游離毒素殘留、偶聯反應溶劑殘留等。
游離毒素作為高風險工藝相關雜質。這類未偶聯小分子因缺乏靶向遞送機制，無法特異性作用于治療靶點，未能提升療效，可能會引發全身毒性風險。此外，工藝開發需同步關注偶聯反應體系中引入的有機溶劑（如DMF、DMSO）、還原劑（如TCEP）等工藝相關雜質的清除效率，確保終產品符合質量屬性放行要求。
結合-洗脫色譜法作為一種常規分離技術，可有效實現ADC中游離毒素的去除。該方法基于ADC與游離毒分子間顯著的理化特性差異，通過選擇性吸附實現高效分離。
在層析工藝中，首先對含有游離毒素及溶劑的偶聯反應體系進行調節到目標上樣條件，隨后上樣至色譜柱，借助離子相互作用選擇性捕獲ADC，游離藥物及殘余溶劑因缺乏有效結合位點而隨流動相直接穿透。
但是部分色譜填料可能與非目標組分（如游離毒素）以及游離毒素可能與ADC存在非特異性相互作用。因此，建議進行系統化的填料篩選，必要時可引入強化淋洗步驟，以確保游離毒素的完全清除。
Fig.2展示了陽離子交換色譜通過結合-洗脫模式去除游離藥物的典型流程。通過上樣過程以及平衡緩沖液的持續淋洗可有效去除殘留的游離毒素（游離毒素含量由52.2%降低至5.0%），從而實現游離毒素與ADC高效分離。
Fig.2 陽離子交換層析純化圖譜
Table 1. 陽離子交換層析純化方法
ADC產品工藝的復雜性，決定了其在偶連工藝結束后可能會導致聚集體含量升高至不可接受的水平，因此在偶聯后引入純化步驟可能是必要的，以確保該工藝能夠滿足所需產品質量要求。
對此可采用陽離子結合-洗脫色譜法，可有效實現ADC中聚集體的去除。如下所示，該方法基于聚集體與單體的理化特性差異實現高效分離，該ADC采用還原鏈間二硫鍵后偶聯，純化方法如下：
• A液90mM NaAC-HAC，pH5；
• B液400mM NaAC-HAC，pH5；
• 載量60mg/mL；
• 洗脫0→100% B液，20CV線性梯度洗脫，分段收集，結果如下所示，可知陽離子層析可以有效去除ADC中殘留的聚集體。
Fig.3 陽離子交換層析聚集體去除結果
博格隆公司創新研發的Diamond CD-S陽離子填料不僅適用于單克隆抗體、雙特異性抗體、融合蛋白等的精細純化，也可滿足ADC生產工藝中游離毒素以及聚集體去除的要求，其具有如下技術優勢：
1、高動態結合載量，其在高鹽濃度下仍具有較高的動態結合載量（10%DBC可達100 g/L，如下圖所示）；
Fig.4 陽離子交換層析Diamond CD-S 動態結合載量圖
2、采用高剛性瓊脂糖微球，具有高流速、低反壓特點，更適用于產業化，耐壓5bar；
3、優異分辨率、穩定的批間一致性；
4、良好的有機溶劑耐受性（15% DMSO加速40℃加速7天穩定性良好），可用于ADC產品純化。
此外，博格隆提供的Diamond SP Mustang等系列陽離子交換層析產品，可完整覆蓋從裸抗精細純化到ADC純化的工藝需求。
參考文獻：[1] Dumontet, Charles , J. M. Reichert , and L. A. Beck . "Antibody-drug conjugates come of age in oncology." Nature reviews Drug discovery 22.8(2023):641-661.
[2] Hutchinson, Matt H., et al. "Process development and manufacturing of antibody-drug conjugates." Biopharmaceutical processing. Elsevier, 2018. 813-836.
[3] Hendricks, Rachel , et al. "Simplified strategy for developing purification processes for antibody-drug conjugates using cation-exchange chromatography in flow-through mode." Journal of chromatography, A: Including electrophoresis and other separation methods 1666-(2022):1666.
[4]劉慧芳等. "一種抗體偶聯藥物的陽離子交換層析純化方法.", CN104208719A. 2014.
