抗體偶聯(lián)藥物（Antibody–drug conjugates，ADCs）被譽為腫瘤治療的“生物導(dǎo)彈”，通過抗體靶向腫瘤細胞，精準釋放細胞毒性載荷，極大提升了療效并降低系統(tǒng)毒性。

自2000年首款A(yù)DC藥物Mylotarg上市以來，全球已有超17款A(yù)DC獲批（截止到2024年），覆蓋血液瘤和實體瘤，市場估值超百億美元。而ADC的復(fù)雜結(jié)構(gòu)（由抗體、連接子及有效載荷組成，如Fig.1所示）對生產(chǎn)工藝提出了極高要求。本文將聚焦陽離子交換層析在ADC高效純化中應(yīng)用。

Fig.1 Anti-CD30 MMAE conjugate (brentuximab vedotin; Adcetris®)結(jié)構(gòu)

生物制品工藝開發(fā)的核心目標在于構(gòu)建穩(wěn)健可控的生產(chǎn)工藝體系，確保可重復(fù)制備出符合預(yù)設(shè)質(zhì)量屬性的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。對于傳統(tǒng)非抗體偶聯(lián)藥物（Non-ADC biologics），其關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Attribute, CQA）包括可能影響臨床安全性與有效性的關(guān)鍵指標，如產(chǎn)品大小相關(guān)變異體（如聚集體、片段）、電荷異質(zhì)性、氧化變體等，工藝相關(guān)雜質(zhì)（宿主細胞蛋白、DNA殘留）、濃度、活性等。而抗體藥物偶聯(lián)物由于兼具生物大分子與化學(xué)小分子的雙重特性，還需額外關(guān)注其他質(zhì)量屬性，包括藥物抗體比率（Drug-to-Antibody Ratio, DAR）、DAR值的組成、游離毒素殘留、偶聯(lián)反應(yīng)溶劑殘留等。

游離毒素作為高風險工藝相關(guān)雜質(zhì)。這類未偶聯(lián)小分子因缺乏靶向遞送機制，無法特異性作用于治療靶點，未能提升療效，可能會引發(fā)全身毒性風險。此外，工藝開發(fā)需同步關(guān)注偶聯(lián)反應(yīng)體系中引入的有機溶劑（如DMF、DMSO）、還原劑（如TCEP）等工藝相關(guān)雜質(zhì)的清除效率，確保終產(chǎn)品符合質(zhì)量屬性放行要求。

結(jié)合-洗脫色譜法作為一種常規(guī)分離技術(shù)，可有效實現(xiàn)ADC中游離毒素的去除。該方法基于ADC與游離毒分子間顯著的理化特性差異，通過選擇性吸附實現(xiàn)高效分離。

在層析工藝中，首先對含有游離毒素及溶劑的偶聯(lián)反應(yīng)體系進行調(diào)節(jié)到目標上樣條件，隨后上樣至色譜柱，借助離子相互作用選擇性捕獲ADC，游離藥物及殘余溶劑因缺乏有效結(jié)合位點而隨流動相直接穿透。

但是部分色譜填料可能與非目標組分（如游離毒素）以及游離毒素可能與ADC存在非特異性相互作用。因此，建議進行系統(tǒng)化的填料篩選，必要時可引入強化淋洗步驟，以確保游離毒素的完全清除。

Fig.2展示了陽離子交換色譜通過結(jié)合-洗脫模式去除游離藥物的典型流程。通過上樣過程以及平衡緩沖液的持續(xù)淋洗可有效去除殘留的游離毒素（游離毒素含量由52.2%降低至5.0%），從而實現(xiàn)游離毒素與ADC高效分離。

Fig.2 陽離子交換層析純化圖譜

Table 1. 陽離子交換層析純化方法

ADC產(chǎn)品工藝的復(fù)雜性，決定了其在偶連工藝結(jié)束后可能會導(dǎo)致聚集體含量升高至不可接受的水平，因此在偶聯(lián)后引入純化步驟可能是必要的，以確保該工藝能夠滿足所需產(chǎn)品質(zhì)量要求。

對此可采用陽離子結(jié)合-洗脫色譜法，可有效實現(xiàn)ADC中聚集體的去除。如下所示，該方法基于聚集體與單體的理化特性差異實現(xiàn)高效分離，該ADC采用還原鏈間二硫鍵后偶聯(lián)，純化方法如下：

• A液90mM NaAC-HAC，pH5；

• B液400mM NaAC-HAC，pH5；

• 載量60mg/mL；

• 洗脫0→100% B液，20CV線性梯度洗脫，分段收集，結(jié)果如下所示，可知陽離子層析可以有效去除ADC中殘留的聚集體。

Fig.3 陽離子交換層析聚集體去除結(jié)果

博格隆公司創(chuàng)新研發(fā)的Diamond CD-S陽離子填料不僅適用于單克隆抗體、雙特異性抗體、融合蛋白等的精細純化，也可滿足ADC生產(chǎn)工藝中游離毒素以及聚集體去除的要求，其具有如下技術(shù)優(yōu)勢：

1、高動態(tài)結(jié)合載量，其在高鹽濃度下仍具有較高的動態(tài)結(jié)合載量（10%DBC可達100 g/L，如下圖所示）；

Fig.4 陽離子交換層析Diamond CD-S 動態(tài)結(jié)合載量圖

2、采用高剛性瓊脂糖微球，具有高流速、低反壓特點，更適用于產(chǎn)業(yè)化，耐壓5bar；

3、優(yōu)異分辨率、穩(wěn)定的批間一致性；

4、良好的有機溶劑耐受性（15% DMSO加速40℃加速7天穩(wěn)定性良好），可用于ADC產(chǎn)品純化。

此外，博格隆提供的Diamond SP Mustang等系列陽離子交換層析產(chǎn)品，可完整覆蓋從裸抗精細純化到ADC純化的工藝需求。

[1] Dumontet, Charles ,  J. M. Reichert , and  L. A. Beck . "Antibody-drug conjugates come of age in oncology." Nature reviews Drug discovery 22.8(2023):641-661.

[2] Hutchinson, Matt H., et al. "Process development and manufacturing of antibody-drug conjugates." Biopharmaceutical processing. Elsevier, 2018. 813-836.

[3] Hendricks, Rachel , et al. "Simplified strategy for developing purification processes for antibody-drug conjugates using cation-exchange chromatography in flow-through mode." Journal of chromatography, A: Including electrophoresis and other separation methods 1666-(2022):1666.

[4]劉慧芳等. "一種抗體偶聯(lián)藥物的陽離子交換層析純化方法.", CN104208719A. 2014.